Pathologische Signaltransduktion bei Krebs - Fokus auf JAK/STAT-Signalweg
Signalaustausch zwischen Krebszellen und mit Zellen der Tumor-Mikroumgebung
Signaltransduktion ist ein zentraler Aspekt des Lebens. Präzise organisierte Verteilung von Informationen im Organismus ist entscheidend für seine Integrität und Homöostase. Im Körper agiert ein extrem komplexes Netzwerk von Zellen, die chemische Signale abgeben, empfangen und verarbeiten. Die Arbeit unseres Labors beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen zellulärer Signaltransduktion und mit Fehlfunktionen dieser Prozesse, wie sie bei Krankheiten auftreten. Ein weites Spektrum von Methoden und Techniken kommt bei dieser Forschung zum Einsatz, das von der Klonierung von DNA über Protein-Biochemie und die Zellkultur bis hin zu in vitro- und in vivo-Krankheitsmodellen reicht. Wir wollen besser verstehen lernen, wie Zellen und Moleküle „miteinander reden“ und haben das Ziel, dadurch zu neuen Entwicklungen auf dem Gebiet der Molekularen Medizin beizutragen.
Die Mitglieder der Arbeitsgruppe kommen aus unterschiedlichen Fächern (u.a. Biochemie, Biotechnologie, (Molekulare) Medizin) und verschiedenen Ländern und verfolgen ihre Forschungsziele auf besonders kooperative Weise. Intensive Zusammenarbeit besteht mit akademischen und industriellen Labors im In- und Ausland. Es gibt immer wieder Möglichkeiten, Abschlussarbeiten (Diplom-, Master- und Bachelorarbeiten sowie Dissertationen) durchzuführen oder im Rahmen von Forschungsaufenthalten und Praktika an unterschiedlichen Projekten mitzuwirken. Bei Interesse nehmen Sie einfach Kontakt auf (karlheinz.friedrich(at)med.uni-jena.de) – „Wir können darüber reden“.
Forschungsarbeiten der letzten Jahre wurden gefördert durch
Seit kurzem sind wir an einem kollaborativen Projekt beteiligt (gefördert durch die Forschungs-Ministerien beider Länder), das die Entwicklung einer neuen diagnostischen Technik auf der Basis der Durchfluss-Zytometrie für die Detektion früher Anzeichen solider Tumoren verfolgt. In diesem Kontext wurde ein Netzwerk akademischer und industrieller Partner initiiert, wodurch der Austausch von Ideen, Materialien sowie von Forschern und Forscherinnen mit ihrem Know-how gefördert werden soll. Mehr Informationen finden sich hier
Aufklärung von Mechanismen, die fehlregulierter Cytokinrezeptor-Aktivierung, Signaltransduktion/Genregulation und intrazellulärer Kommunikation bei asthmatischen Erkrankungen zugrunde liegen. Entwicklung von Ansätzen zur gezielten Inhibition von krankheitsrelevanten Cytokinrezeptor-Funktionen
Allergische Erkrankungen vom Soforttyp wie allergisches Asthma bronchiale sind charakterisiert durch erhöhte Serumkonzentrationen von IgE, Infiltration der betroffenen Gewebe durch inflammatorische Zellen und eine Th2-dominierte Immunreaktion. Fehlregulierte Cytokinfunktionen sind entscheidend sowohl an akuten als auch chronischen Symptomen dieser Krankheitsbilder beteiligt. Wir haben uns zuletzt auf zwei Cytokine konzentriert, die beide ihre Wirkungen über heterodimere Cytokin-Rezeptoren und nachgeschaltete JAK/STAT-Signalwirkungen auslösen und zentrale Funktionen im Asthma-Geschehen haben: Interleukin-13 (IL-13) und Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP).
IL-13 ist ein Cytokin mit vielfältigen Rollen in normalen Immunprozessen und entzündlichen Erkrankungen. Es wird hauptsächlich von aktivierten T-Zellen produziert, aber auch von anderen Zelltypen wie Mastzellen, Basophilen, Eosinophilen und dendritischen Zellen. IL-13 ist strukturell und funktionell eng mit dem bedeutendsten Th2-Cytokin IL-4 verwandt und ist wie IL-4 in der Lage, einen Immunglobulin-Klassenwechsel nach IgE zu induzieren. Dennoch hat es spezifische und entscheidende Funktionen bei der Ausprägung von allergischem Asthma und seinen Symptomen (Hyperreagibilität gegenüber spezifischen Antigenen, erhöhte IgE-Levels, verstärkte Schleimbildung in den Atemwegen und subepitheliale Fibrosierung).
TSLP ist ein IL-7-ähnliches Cytokin, dem in jüngerer Zeit zentrale Bedeutung bei der Entwicklung allergischer Symptome, insbesondere in den Atemwegen zugeordnet wird. Es fungiert zudem als Hauptregulator an der Schnittstelle von Epithelzellen, die Viren oder Antigenen ausgesetzt sind und dendritischen Zellen. TSLP stellt eine funktionelle Verbrückung zwischen dem Allergenkontakt des Atemwegsepithel einerseits und der Ausbildung kurz- und langfristiger asthmatischer Erscheinungen andererseits dar. Es ist daher von profundem Interesse für ein besseres Verständnis der Krankheit und die Entwicklung neuer Therapeutika, Signaltransduktionsprozesse aufzuklären, die der Expression und Wirkung von TSLP zugrunde liegen. Der TSLP-Rezeptor besteht aus einer spezifischen TSLPR a-Kette und der IL-7 Receptor a-Kette. Nach Liganden-induzierter Aktivierung steuert er Signalwege über Janus-Kinasen (JAKs) und Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) und beeinflusst Zellproliferation und spezifische Genregulation (siehe Fig. A).
Wir haben rekombinante Cytokin-Rezeptoren in lymphoiden Zelllinien exprimiert, um mit Hilfe von Westernblot- und Reportergen-Experimenten die durch IL-13 und TSLP induzierte intrazelluläre Signaltransduktion zu studieren. Diese Arbeiten führten u.a. zur Identifizierung von Janus-Kinasen und STAT-Faktoren, die am TSLP-Signaling beteiligt sind. Darüber hinaus werden die Effekte beider Cytokine auf primäre Epithelzellen und Fibroblasten der Atemwege analysiert, um krankheitsrelevante Differenzierungsprozesse zu verstehen, z.B. die Expression von pro-apoptotischen Genen und Genen mit Funktionen bei der Fibrosierung. Diese Untersuchungen zeigten beispielsweise eine Rolle von IL-13 bei der Entwicklung von Fibrose auf, einer späten Konsequenz von chronischem Asthma.
Auf der Basis von Maus-Lymphocyten wurden zelluläre Testsysteme etabliert, die IL-13- und TSLP-abhängige Signalprozesse nachstellen. Hierbei wird die funktionelle Rekonstitution von Cytokin-Rezeptoren cytometrisch und durch Westernblot-Studien erfasst. Der Einsatz von STAT-spezifischen Reportergen-Konstrukten ermöglicht die Quantifizierung von Cytokin-Effekten und die Analyse von beteiligten intrazellulären Reaktionen. Laufende Studien zielen auf die Entwicklung von inhibitorischen Substanzen für Signaltransduktionsprozesse ab, die bei Asthma eine Rolle spielen. Insbesondere werden unterschiedliche Methoden eingesetzt („klassische“ Hybridom-Technik zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern und rekombinante Antikörper-Erzeugung), um Antikörper zu generieren, die effizient Allergie-relevante Signalauslösung durch die Rezeptoren für IL-13 und TSLP blocken können. Diese Reagenzien dienen als potentielle Ausgangsstrukturen für die Entwicklung von Wirkstoffen, die die krankheitsauslösenden Aktivitäten von IL-13 oder TSLP beeinflussen können.
Im Verlauf unserer Charakterisierung eines Antikörpers gegen die TSLP-Rezeptor a-Kette konnten wir (als Nebenprojekt) auch zeigen, dass dieses Reagenz die TSLP-abhängige Proliferation von malignen B-Zellen reduzieren kann, die bei einer speziellen Form von Akuter Lyphoider Leukämie (ALL) beobachtet wurde.
Im Verlauf unserer Studien haben wir den heterodimeren TSLP-Rezeptor zu einer generell adaptierbaren Plattform zur Bestimmung von Aktivitäten von Cytokinen/Wachstumsfaktoren entwickelt (Fig. B). Dieses System beruht auf der Etablierung von Zellen, die „maßgeschneiderte“ Hybridrezeptoren exprimieren. Es hat sich als außerordentlich nützlich in Projekten erwiesen, die sich mit der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für Cytokine/Wachstumsfaktoren mit Rollen bei krankhaften Prozessen erwiesen.
Molekulare Analyse fehlgeleiteter Signaltransduktionsprozesse in Krebszellen und Korrelation mit malignem Zellverhalten und Tumorprogression
Signaltransduktion über Janus Kinasen (JAKs) und Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) ist essentiell für eine Vielzahl fundamentaler Zellfunktionen wie Proliferation und Differenzierung. Am intensivsten untersucht wurde die Steuerung von JAK/STAT-Signalwegen durch Cytokin-Rezeptoren. Nach ligandeninduzierter Rezeptordimerisierung phosphorylieren JAKs Tyrosinreste im Rezeptor und erzeugen dadurch Bindungsstellen für Protein mit SH2-Domänen, z.B. STATs. Im Zuge ihrer Wechselwirkung mit dem Cytokin-Rezeptorkomplex werden STATs selbst phosphoryliert. Sie dimerisieren daraufhin und translozieren in den Zellkern, wo sie an Erkennungsmotive in der DNA binden und die Transkription von Cytokin-Zielgenen modulieren. Fehlregulierte Aktivität von JAK/STAT-Signalwegen wurde in verschiedenen menschlichen Krebsarten beobachtet.
Ein besonders wichtiger Aspekt der Tumor-Malignität ist die Fähigkeit von Tumorzellen, invasiv zu wachsen und schließlich Metastasen an entfernten Orten im Organismus zu bilden. STAT3 ist an der Organisation von Tumor-Stroma-Interaktionen und der Ausbildung zellulärer Invasivität beteiligt. STAT1 hat hingegen offenbar tumorsuppressive Eigenschaften. Diese Erkenntnisse machen die Analyse der Beiträge von STATs zum invasiven Verhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo zu einem wichtigen Forschungsgegenstand.
Wir studieren die Bedeutung entgleister JAK/STAT-Signaltransduktion in verschiedenen menschlichen Tumorformen (z.B. kolorektales, Lungen- und Blasenkarzinom). Die Experimente zielten auf Fragen ab, in wie weit fehlregulierte STAT-Aktivität im Krebsgewebe vorliegt, ob sie bedeutsam für die Malignität der jeweiligen Tumoren ist und welche Signalmechanismen die Aktivitäten von STAT-Faktoren und anderen Molekülen mit pathogenen Eigenschaften verknüpfen.
Konstitutive Tyrosinphosphorylierung und DNA-bindende Aktivität von STAT3 und STAT1 wurde in der Mehrzahl der untersuchten bösartigen Kolorektal (CRC)- und Lungentumoren gefunden. Fig. A zeigt spezifische STAT-DNA-Interaktionen, die durch Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und Immunhistochemie unter Verwendung eines Antikörpers gegen pTyr-STAT3 (Fluoreszenzsignal) untersucht wurden.
Ein anderer Aspekt der zuletzt verfolgen Arbeiten ist die Untersuchung der STAT-abhängigen Genregulation. Wir beobachteten eine Assoziation von STAT1- und STAT3-Aktivität mit der veränderten Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und studierten molekulare Mechanismen, die der transkriptionellen Kontrolle des MMP-1 Promoters zu Grunde liegen.
Ein Nebenprojekt beschäftigte sich mit Strategien zur spezifischen Inhibition der oncogenen Signaltransduktion von konstitutiv aktiven Ras-Proteinen. Ein viel versprechender Ansatz wurde entwickelt, der auf dem Einsatz von multimerisierten Proteindomänen beruht, die
oncogenes Ras in Tumorzellen binden und inaktivieren können.
Aufklärung von Kommunikationsprozessen zwischen Krebszellen und mit Zellen der Tumor-Mikroumgebung zum besseren Verständnis der Rolle des Tumorstromas in der Krebsprogression
Die Forschung hat in der jüngeren Zeit Mechanismen aufgedeckt, über die Tumorzellen sowohl untereinander als auch mit aktivierten Fibroblasten, Zellen des Endothels, Entzündungs- und Immunzellen sowie mit der extrazellulären Matrix interagieren. Alle diese Signalaustauschprozesse haben funktionelle Beziehungen zu sekretierten Faktoren wie Cytokinen und Transmembran-Rezeptoren.
Krebs- und Stromazellen betreiben eine intensive Kommunikation und unterliegen daher auch einer Co-Evolution. Dem Tumorstroma werden daher inzwischen entscheidende Beiträge bei der Etablierung, Progression und Verbreitung von Tumoren zugeschrieben. Darüber hinaus haben sich sogenannte Stroma-Nischen als wichtige Determinanten der Tumor-Metastasierung erwiesen. Dennoch ist die krankheitsrelevante Kommunikation von Tumorzellen und Tumorstroma nur in Ansätzen verstanden. Fortschritte bei der Definition spezifischer Funktionen der Mikroumgebung in der Tumorbiologie tragen dazu bei, das Tumorstroma und seinen Signalaustausch mit Tumorzellen als Zielstrukturen für zukünftige fortgeschrittene Krebstherapien zu erschließen. Um hier Fortschritte zu erzielen, werden gegenwärtig viele Anstrengungen unternommen, Protokolle zur Co-Kultivierung von Krebs- und Stromazellen zu entwickeln und in vivo-Interaktionen experimentell nachzustellen.
Signale von Stromazellen, z.B. von Tumor-assoziierten Fibroblasten sind an der Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) beteiligt, einem Kernelement zellulärer Ent-Differenzierung und Entwicklung kanzeröser Eigenschaften. EMT wird durch eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren voran getrieben (Snail, Slug, Zeb etc.), die u.a. die Lockerung von Zell-Zell-Kontakten begünstigen, z.B. durch Repression der Expression von E-Cadherin.
Die Malignität von Krebszellen wird auch durch Interaktionen zwischen Tumorzellen über Transmembran-Proteine gesteuert. Ein wichtiges Molekül mit zentraler Bedeutung für die Zell-Zell-Kommunikation (zwischen Krebszellen und auch mit Fibroblasten) ist EMMPRIN (Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer). EMMPRIN kommt sowohl in membranassoziierter als auch in löslicher Form vor (letztere entsteht durch spezifische Freisetzung der extrazellulären Domäne durch Shedding). Die genauen Rollen von EMMPRIN in Tumorigenese und –progression sind wenig verstanden.
Unsere Arbeiten haben sich in der letzten Zeit konzentriert auf zwei Aspekte konzentriert: (i) Den Crosstalk zwischen Krebszellen und Tumor-assoziierten Fibroblasten sowie auf zu Grunde liegende Funktionen von Cytokinen und intrazellulären Signalmediatoren wie Transkriptionsfaktoren und (ii) die Rollen des Zelloberflächen-Moleküls EMMPRIN bei der Entwicklung maligner Eigenschaften von Krebszellen.
Wir haben die Kommunikation zwischen Tumorzellen und unterschiedlichen Arten von Fibroblasten analysiert und dabei Harnblasenkrebs-Zelllinien als Tumorzell-Modell verwendet. Sie wurden separat oder zusammen mit Tumor-assoziierten Fibroblasten kultiviert bzw. co-kultiviert. Migratorische und invasive Eiigenschaften von Tumorzellen und Fibroblasten wurden durch „Wundheilungs“- und andere Assays quantifiziert. Cytokinproduktion von Zellen wurde durch intrazelluläre Färbung mit anschließender Cytometrie oder Analyse von konditionierenden Medien mittels ELISA oder Western Blot vermessen. Wir konnten Faktoren, die von Tumorzellen bzw. von Fibroblasten sezerniert werden identifizieren und zudem zeigen, dass sie im jeweils anderen Zelltyp Experssionsänderungen von krebsrelevanten Genen bewirken, z.B. von Genen für Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Als besonders wichtige sekretierte lösliche Faktoren, die zelluläre Malignität fördern konnten wir IL-1a (Interleukin-1a) und HGF (Hepatocyten Wachtumsfaktor) identifizieren (Fig. A).
Wir haben die Effekte von EMMPRIN auf Malignitäts-Parameter in Brustkrebszellen studiert. Als Werkzeuge für diesen Zweck wurde eine rekombinante Form von löslichem EMMPRIN sowie Zellen mit genetisch ausgeschalteter EMMPRIN-Expression (knock down) erzeugt. Eine Analyse der Aktivität von löslichem EMMPRIN zeigte einen stimulatorischen Effekt auf die Zellproliferation. Andererseit erwies sich das Protein als repressiv für die Zellmigration (untersucht mittels „Wundheilungs- oder „Scratch“-Assay, Fig. B). Offensichtlich kann EMMPRIN das Malignitätsprofil von Tumorzellen auf spezifische Weise verändern und ist daher eine Determinante der zellulären Tumorigenität. Diese Interpretation der Ergebnisse wird weiterhin unterstützt durch Befunde, die einen Crosstalk der EMMPRIN-gesteuerten Signaltransduktion mit anderen krebsrelevanten Signalwegen wie der Wnt- und JAK/STAT-Kaskade belegten.
Seit kurzem sind wir an einem kollaborativen Projekt beteiligt (gefördert durch die Forschungs-Ministerien beider Länder), das die Entwicklung einer neuen diagnostischen Technik auf der Basis der Durchfluss-Zytometrie für die Detektion früher Anzeichen solider Tumoren verfolgt. In diesem Kontext wurde ein Netzwerk akademischer und industrieller Partner initiiert, wodurch der Austausch von Ideen, Materialien sowie von Forschern und Forscherinnen mit ihrem Know-how gefördert werden soll. Mehr Informationen finden sich hier
