Forschungsgebiete der Arbeitsgruppe Schmidt

Arbeitsgruppe Stoffwechselregulation (Dr. Martin Schmidt)

Steroidmetabolismus und Entzündung

Aromatase – Transkriptionsmechanismen, Rolle bei Brustkrebs und krankheits­relevante Varianten

Mechanismen der Fettzell-Differenzierung und des Fettzell-Verlustes

Mechanismen der regiospezifischen Regulation der Gehirndurchblutung

Kooperationsprojekte: Analytik von Biomolekülen, DyeBone, Innolmplant 

Forschungsinteressen

Die Arbeitsgruppe untersucht verschiedene Aspekte der Stoffwechselregulation. Dabei interessieren uns sowohl grundlegende Mechanismen der physiologischen Regulation als auch pathologische Veränderungen. Die meisten Mitglieder unserer Arbeitsgruppe sind Medizindoktorand(inn)en.

Die in unserer Gruppe bearbeiteten Themen haben ihren Ursprung in verschiedenen klinischen Fragestellungen, die mit den Schlagworten Adipositas, Brustkrebs und Autoimmunerkrankungen (insbesondere rheumatoide Arthritis) assoziiert sind.

Schwerpunkte unserer experimentellen Arbeiten sind Untersuchungen zur Regulation von Genexpression und Enzymaktivitäten als Grundlagen eines (pathologisch) veränderten Stoffwechsels. Besonders interessieren wir uns dabei für Proteine, Nukleotide, Lipide und Steroide dar.

Methoden

Für unsere Untersuchungen nutzen wir ein breites Spektrum an Methoden:

• Zellkultur (u.a. Isolierung und Kultivierung primärer Zellen, Zellinien, in vitro Differenzierung)
• Metabolische Tests (u.a. Steroidmetabolismus, Glukose- und Fettstoffwechsel, HPLC-Analytik, Radionuklid-Tracer, Fluoreszenz- und Lumineszenz-basierte Testsysteme)
• Proteinbiochemie (u.a. Proteinreinigung, Proteinexpression, Western Blot, Southwestern Blot, EMSA, Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie [Kooperation])
• Molekularbiologie (u.a. RT-PCR, Genexpression, Reportergen-Assays, RNA-Interferenz, Chromatin-Immunpräzipitation [ChIP])
• Zellbiologie (u.a. Fluoreszenzmikroskopie, Enzymaktivitätsmessungen in intakten Zellen, Calcium-Monitoring, cAMP-Messungen, ROS-Monitoring)

Steroidmetabolismus und Entzündung

Steroide haben vielfältige Wirkungen auf Zellen des Immunsystems und werden von diesen auch in verschiedener Weise metabolisiert. Bekanntestes Beispiel sind Glucocorticoide, die als physiologische und pharmakologische Entzündungshemmer wirken. Ihre anti-entzündliche Wirksamkeit hängt unter anderem  von der Effizienz ihrer Inaktivierung im Entzündungsgebiet selbst ab.

Neben den Glucocorticoiden wirken verschiedene weitere Steroide immunmodulierend, darunter Androgene, Estrogene bzw. deren Metaboliten. Dies ist im Hinblick auf entzündliche Erkrankungen und vor allem für eine Reihe von Autoimmunerkrankungen unter anderem deshalb von Interesse, weil es klare geschlechtsspezifische Unterschiede in ihrer Häufigkeit gibt. So ist z.B. das Risiko, an rheumatoider Arthritis zu erkranken, für Frauen etwa dreimal so hoch wie bei Männern. Hier gleichen sich die Erkrankungshäufigkeiten erst mit höherem Alter an. Daraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass entweder ein „typisch weibliches“ Hormon die rheumatoide Arthritis fördert, ein „typisch männliches“ Hormon die rheumatoide Arthritis hemmt oder eine Kombination beider Mechanismen für die geschlechtsspezifischen Unterschiede verantwortlich ist. Aus klinischen Studien ist bekannt, dass die therapeutische Gabe von Androgenen die Symptome der rheumatoiden Arthritis sehr deutlich mildert, was zumindest auf einen relativen Androgenmangel als möglichen Faktor hinweist.

Wir konnten zeigen, dass bei Arthritis am Entzündungsort tatsächlich ein extremer Androgenmangel herrscht und enorme Estrogenmengen angehäuft werden. Dies lässt sich durch die Induktion der Aromatase während der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen erklären. Interessanterweise produzieren sowohl gemischte Zellpopulationen aus entzündlichem Gewebe als auch eine Reihe von typischen hämatopoetischen Zellinien neben den klassischen Androgenen und Estrogenen eine Palette von Metaboliten dieser Steroide, von denen einige bei vorliegender rheumatoider Arthritis in signifikant größeren Mengen gefunden werden, als bei Kontrollen.

Derzeit werden die Wirkungen von Entzündung und inflammatorischen Faktoren auf den lokalen Steroidmetabolismus in verschiedenen Zellkulturmodellen und in primären Synovialzellen untersucht und in Beziehung zur Wirkung der Metaboliten auf Parameter des Entzündungsgeschehens gesetzt. Daraus w erden tatsächlich entzündungsmodulierende Metaboliten identifiziert bzw. bestätigt. Für deren Bildung relevante Enzyme wurden identifiziert und genetische Varianten werden auf ihre Rolle bei der Entstehung der rheumatoiden Arthritis untersucht.

So konnten wir kürzlich zeigen (http://arthritis-research.com/content/17/1/56), dass ein singulärer Nukleotidpolymorphismus (SNP) im für Cytochrom b5 Typ A kodierenden Gen CYB5A das Risiko, an rheumatoider Arthritis zu erkranken, selektiv für Frauen reduziert. Dabei führt die protektive Variante des SNP zu einer Verdoppelung der CYB5A-mRNA-Expression, was zu einer 2-3-fach gesteigerten Aktivität der von Cytochrom b5 abhängigen Steroid-17,20-Lyase und entsprechend gesteigerter Androgenproduktion führt. Somit liegt die Schlussfolgerung nahe, dass eine moderate Erhöhung der Androgenspiegel bei Frauen die Entwicklung einer rheumatoiden Arthritis hemmen könnte, während bei Männern dieser Mechanismus aufgrund ihrer höheren Androgenspiegel nicht zum Tragen kommt.

Abb.2. Steroidmetabolismus ausgehend von Pregnenolon (Preg). Das bei Frauen protektive A-Allel eines CYB5A-SNPs verursacht verstärkte Transkription von CYB5A, was die 17,20-Lyase-Aktivität des unverändert transkribierten CYP17A1 erhöht. Dadurch wird vermehrt 17α-Hydroxypregnenolon (17αOH-Preg) zu Dehydroepiandrosteron (DHEA) konvertiert, das wiederum Vorläufer für die Synthese weiterer Androgene ist: Δ5-Androstendiol (Δ5Adiol), Androstendion (Adion) und Testosteron (Testo). Die Synthese von Progesteron (Prog) bzw. 17α-Hydroxyprogesteron (17αOH-Prog) bleibt weitgehend unverändert. Komplette Studie siehe Arthritis Res Ther 2015, 17: 56.

Ziel unserer Untersuchungen ist letztlich die Identifizierung eines entzündungsspezifischen Steroid-Metaboliten bzw. Mechanismus, der Ansatzpunkt für eine potentiell nebenwirkungsarme Therapieoption bieten könnte.

Ausgewählte Referenzen

• Schmidt M, Kreutz M, Löffler G, Schölmerich J, Straub RH. Conversion of dehydroepiandrosterone to downstream steroid hormones in macrophages.
  J Endocrinol. 2000, 164:161-169.
• Weidler C, Struharova S, Schmidt M, Ugele B, Scholmerich E, Straub RH. Tumor necrosis factor inhibits conversion of dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) to DHEA in rheumatoid arthritis synovial cells - A prerequisite for local androgen deficiency.
  Arthritis Rheum 2005, 52:1721-1729.
• Schmidt M, Weidler C, Naumann H, Anders S, Scholmerich R, Straub RH. Reduced capacity for the reactivation of glucocorticoids in rheumatoid arthritis synovial cells - Possible role of the sympathetic nervous system?
  Arthritis Rheum 2005, 52:1711-1720.
• Schmidt M, Weidler C, Naumann H, Anders S, Scholmerich J, Straub RH. Androgen conversion in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synoviocytes - androstenedione and testosterone inhibit estrogen formation and favor production of more potent 5 alpha-reduced androgens.
  Arthritis Res Ther 2005, 7:R938-R948.
• Schmidt M, Hartung R, Capellino S, Cutolo M, Pfeifer-Leeg A, Straub RH. Estrone/17beta-estradiol conversion to, and tumor necrosis factor inhibition by, estrogen metabolites in synovial cells of patients with rheumatoid arthritis and patients with osteoarthritis.
  Arthritis Rheum 2009, 60:2913-2922.
• Capellino S, Cosentino M, Wolff C, Schmidt M, Grifka J, Straub RH. Catecholamine-producing cells in the synovial tissue during arthritis: modulation of sympathetic neurotransmitters as new therapeutic target.
  Ann Rheum Dis 2010, 69, 1853-1860.
• Stark K, Straub RH, Rovensky J, Blažičková S, Eiselt G, Schmidt M. CYB5A polymorphism increases androgens and reduces risk of rheumatoid arthritis in women.
  Arthritis Res Ther 2015, 17: 56. DOI: 10.1186/s13075-015-0574-9

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Aromatase – Transkriptionsmechanismen, Rolle bei Brustkrebs und krankheits­relevante Varianten

Estrogene – als (weibliche) Sexualhormone lange bekannt – können nicht nur in den Gonaden, sondern in einer Vielzahl von Geweben synthetisiert werden. Dabei stellt das Fettgewebe den
Hauptort der Erzeugung zirkulierender Estrogene bei postmenopausalen Frauen und bei Männern dar. Estrogene wirken als Signalmoleküle nicht nur auf die Gonaden selbst, sondern auf eine Vielzahl von Geweben, darunter Brustdrüse, Knochen und nicht zuletzt das Fettgewebe bzw. den Energiestoffwechsel. So beruht die Wirksamkeit der Anti-Estrogen-Therapie bei der Behandlung von Brustkrebs auf der Abhängigkeit vieler Brusttumoren von der wachstumsfördernden Wirkung von Estrogenen. Allerdings führt der Estrogen-Entzug zur Verstärkung des altersbedingten Verlustes von Knochenmasse.

Ein möglicher Ausweg aus dieser Kopplung erwünschter Wirkung mit unerwünschter Nebenwirkung bei der Therapie besteht im Einsatz sog. selektiver Estrogen-Rezeptor Modulatoren. Ein zweiter Ansatz, der sich ggf. auch präventiv nutzen ließe, versucht, gewebespezifische Transkriptionsmecha­nismen der Aromatase als Target für gezieltere Therapien zu identifizieren.

Wir untersuchen Signaltransduktionsmechanismen, die zur Induktion bzw. Repression der Aromatase im Fettgewebe führen. Dabei ist im Hinblick auf die etablierte Rolle der Aromatase des Fettgewebes bei malignen Brusttumoren für uns interessant, ob sich von Tumoren freigesetzte Aromatase­induktoren für die (Früh)Diagnostik bzw. für die Prognosedifferenzierung eignen. Umgekehrt können auch Faktoren, die im Fettgewebe selbst produziert oder angehäuft werden, durch Induktion der Aromatase zur Versorgung eines Tumors mit Estrogenen beitragen. Die Identifizierung eines auf der Wirkung von Retinsäure beruhenden neuen Induktionsmechanismus in Fettvorläuferzellen bestätigt diese These (http://jme.endocrinology-journals.org/content/51/2/247.long).

Abb.3. Retinoide induzieren Aromatase-Reportergen-Aktivität in Fettvorläuferzellen über das Retinoid Response Element 2 (RARE2) im Aromatase-Promotor I.4. A: Promotorsequenz mit putativen RAREs. B: Verwendete Luciferase-Reportergen-Konstrukte. C: Nur Mutagenese von RARE2 blockiert die Retinoid-vermittelte Induktion. D: Rückmutation zum RARE2-Wildtyp bestätigt, dass RARE2 verantwortlich ist. Komplette Studie siehe J Mol Endocrinol 2013, 51:247-260.

Erhebliche Bedeutung für das Verständnis molekularer Ursachen von Phänotyp-Variationen hat die Analyse von Mutationen bzw. Polymorphismen. Deshalb betreiben wir die molekulare Analyse von Varianten im Aromatasegen und versuchen, deren Auswirkungen auf den Phänotyp zu erklären. Je nach Art der Variante (Enzymaktivität aktivierend oder inhibierend) und Geschlecht der Betroffenen können die phänotypischen Auswirkungen sehr unterschiedlich sein – von fast undetektierbar bis zu schwerwiegenden körperlichen und sexuellen Fehlentwicklungen.

Ziel dieser Arbeiten ist ein verbessertes Verständnis krankheitsrelevanter Störungen der Estrogensynthese, das Grundlage für präzisere diagnostische und prognostische Testverfahren ist.

Ausgewählte Referenzen

• Schmidt M, Löffler G. The human breast cancer cell line MDA-MB231 produces an aromatase stimulating activity.
  Eur J Cell Biol. 1994, 63:96-101.
• Schmidt M, Renner C, Löffler G. Progesterone inhibits glucocorticoid-dependent aromatase induction in human adipose fibroblasts.
  J Endocrinol. 1998, 158:401-407.
• Binder G, Iliev DI, Dufke A, Wabitsch M, Schweizer R, Ranke MB, Schmidt M. Dominant transmission of prepubertal gynecomastia due to serum estrone excess: Hormonal, biochemical, and genetic analysis in a large kindred.
  J Clin Endocrinol Metab 2005, 90:484-492.
• Wilde J, Erdmann M, Mertens M, Eiselt G, Schmidt M. Aromatase activity induction in human adipose fibroblasts by retinoic acids via retinoic acid receptor α.
  J Mol Endocrinol 2013, 51:247-260, doi: 10.1530/JME-12-0129.
• Kaiser A, Krüger T, Eiselt G, Bechler J, Kniemeyer O, Huber O, Schmidt M. Identifikation of PARP-1, Histone H1 and SIRT-1 as new regulators of breast cancer-related aromatase promoter I.3/II. Cells 2020, 9:E427. doi:10.3390/cells9020427.

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Mechanismen der Fettzell-Differenzierung und des Fettzell-Verlustes

Die Aufrechterhaltung einer ausreichenden Zahl funktioneller Zellen ist in allen Geweben und während des gesamten Lebens eines Organismus erforderlich. Praktisch immer führt ein Mangel genauso wie ein Überschuss eines bestimmten Zelltyps (bzw. bestimmter zellulärer Funktionen) zu erheblichen Störungen im gesamten Organismus.

Dies gilt auch für das Fettgewebe, dessen übermäßige Anhäufung allgemein als krankheitsrelevant betrachtet wird. Weniger bekannt ist die Tatsache, dass ein partieller oder vollständiger Verlust des Fettgewebes (Lipodystrophie bzw. Lipoatrophie) für die betroffenen Patienten häufig wesentlich akuter mit teils lebensbedrohlichen metabolischen Komplikationen einhergeht.

Wir untersuchen an einer Reihe von Modellen Mechanismen, die für übermäßige bzw. verringerte Fettzell-Differenzierung oder einen pathologischen Fettzell-Verlust verantwortlich sein könnten. Dabei konzentrieren wir uns auf zwei Schwerpunkte:

a) Die Rolle von Nukleotiden als Signalmoleküle im Fettgewebe und die zur Signalvermittlung erforderlichen P2-Rezeptoren.

Nukleotide sind nicht nur Synthesebausteine und Energielieferanten bei intrazellulären Reaktionen, sondern auch parakrine Signalmoleküle, die in einer Vielzahl von Geweben wirken. Wir haben in verschiedenen Zelltypen des Fettgewebes P2-Rezeptoren identifiziert und ihre Beteiligung an der Regulation wesentlicher Funktionen des Fettgewebes gezeigt, z. B. Regulation von Lipogenese und Lipolyse, aber auch Regulation der Estrogensynthese in Präadipozyten.

Derzeit werden von uns beteiligte Rezeptoren auf zellulärer und molekularer Ebene charakterisiert, sowie die beteiligten Signaltransduktionsmechanismen untersucht.

Abb.4: Verschiedene Nukleotide können durch Aktivierung diverser Nukleotidrezeptoren zur Aktivierung unterschiedlicher Signalwege beitragen. Die gleichzeitige Expression mehrerer Rezeptoren, der Abbau von Nukleotiden und die eigenständige Wirksamkeit von Abbauprodukten (hier gezeigt Adenosin (Ado)) erhöhen die Komplexität dieses Signalsystems.

b) Induzierter Zelluntergang im Fettgewebe.

Der gesteuerte Zelltod gehört mit zu den grundlegenden Prozessen, die die Integrität eines Organismus und seiner Organe sicherstellen. Pathologische Prozesse und therapeutische Eingriffe können dieses Gleichgewicht zum Nachteil oder zum Vorteil der Betroffenen verschieben.

Hier werden von uns pathologische Mechanismen untersucht, die zum Untergang von Fettzellen führen. Derartige Mechanismen lassen sich z.B. von Wirkstoffkandidaten aktivieren, die über eine Schädigung der Mitochondrienfunktion wirken.

Abb.5: Der Einbau von Triacylglycerinen in die Lipidspeicher der Fettzellen kann durch Oil Red O-Färbung sichtbar gemacht werden. Links sind in vitro differenzierte humane Fettzellen dargestellt. Rechts sind Zellen dargestellt, die mit einem Antagonisten der Fettzelldifferenzierung behandelt wurden.

Ausgewählte Referenzen

• Schmidt M, Löffler G

  Induction of aromatase activity in human adipose tissue stromal cells by extracellular nucleotides--evidence for P2-purinoceptors in adipose tissue. Eur J Biochem. 1998, 252: 147-154.

• Schödel J, Weise I, Klinger R, Schmidt M

  Stimulation of lipogenesis in rat adipocytes by ATP, a ligand for P2-receptors. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 321:767-773.

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Mechanismen der regiospezifischen Regulation der Gehirndurchblutung

Die Aufrechterhaltung einer ausreichenden Durchblutung des Gehirns wird durch autoregulatorische Mechanismen bewirkt. Ausgehend von Szenarien der Notfallmedizin wird in Zusammenarbeit mit der AG Schiffner (Klinik für Orthopädie / Waldkrankenhaus Rudolf Elle) die Frage nach Ursachen unterschiedlich ausgeprägter Autoregulation in Cortex bzw. evolutionär älterer Hirnregionen bearbeitet.

Im Mittelpunkt steht dabei die Frage nach der Rolle von α₁-adrenergen Rezeptoren. Diese vermitteln in vielen Geweben eine Katecholamin-stimulierte Kontraktion arterieller Gefäße. Unsere Befunde legen jedoch Nahe, dass in Hirngefäßen α_1A-adrenerge Rezeptoren aber auch für eine erfolgreiche Autoregulation erforderlich zu sein scheinen.

Ausgewählte Referenzen

• Bischoff S*, Schmidt M*, Lehmann T, Irintchev A, Schubert H, Jung C, Schwab M, Huber O, Matziolis G, Schiffner R

  Increase of cortical cerebral blood flow and further cerebral microcirculatory effects of Serelaxin in a sheep model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016, 311:H613-H620.

• Schiffner R, Bischoff SJ, Lehmann T, Rakers F, Rupprecht S, Reiche J, Matziolis G, Schubert H, Schwab M, Huber O, Schmidt M

  Redistribution of Cerebral Blood Flow during Severe Hypovolemia and Reperfusion in a Sheep Model: Critical Role of α1-Adrenergic Signaling. Int J Mol Sci. 2017, 18:1031.

• Nistor M, Behringer W, Schmidt M, Schiffner R

  A Systematic Review of Neuroprotective Strategies during Hypovolemia and Hemorrhagic Shock. Int J Mol Sci. 2017, 18:2247.

• Schiffner R, Bischoff SJ, Lehmann T, Rakers F, Rupprecht S, Matziolis G, Schubert H, Schwab M, Huber O, Lemke C, Schmidt M

  Underlying mechanism of subcortical brain protection during hypoxia and reoxygenation in a sheep model - Influence of α1-adrenergic signalling. PLoS One. 2018,13:e0196363.

• Schiffner R, Bischoff SJ, Lehmann T, Irintchev A, Nistor M, Lemke C, Schmidt M

  Altered cerebral blood flow and potential neuroprotective effect of human Relaxin-2 (Serelaxin) during hypoxia or severe hypovolemia in a sheep model. Int J Mol Sci 2020,21:E1632. doi: 10.3390/ijms21051632.

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Kooperationsprojekte:

Analytik von Biomolekülen

Zwei vom Freistaat Thüringen im Schwerpunkt „Förderung von Forschung, Technologie und Innovation (FTI-Richtlinie): Gesundes Leben und Gesundheitswirtschaft“ geförderte Vorhaben werden durch Mittel der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) kofinanziert:

DyeBone

Entwicklung einer Färbemethode und eines Detektionssystems zur Beurteilung der Vitalität des Knochens zum intraoperativen Einsatz (DyeBone).

Dabei bilden in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Orthopädie des Waldkrankenhauses Rudolf Elle in Eisenberg und Jenaer Firmen derzeit Untersuchungen zur Vitalfärbung von Knochenfragmenten einen Schwerpunkt.

Innolmplant

In-vivo und in-vitro-Testung neuartiger Materialien für den Gelenkersatz bzw. für orthopädisch-chirurgische Instrumente am Schaf als Großtiermodell sowie in Zellkultursystemen, welches im Gesamtprojekt "Zementfreie, antibakteriell funktionalisierte, keramische Femurkondyle mit metallfreiem Instrumentarium (KeraKon) durchgeführt wird. Dabei handelt es sich ebenfals um eine Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Orthopädie des Waldkrankenhauses Rudolf Elle in Eisenberg und thüringer Firmen.

Ausgewählte Referenzen

• Till O, Schmidt M, Linss W, Baumann E

  Detection of bis(sulfosuccinimidyl) suberate binding in electrophoresis: Determination of membrane sidedness of proteins. Electrophoresis 2007, 28:740-745.

• Telleria-Diaz A*, Schmidt M*, Kreusch S, Neubert AK, Schache F, Vazquez E, Vanegas H, Schaible HG, Ebersberger A

  Spinal antinociceptive effects of cyclooxygenase inhibition during inflammation: Involvement of prostaglandins and endocannabinoids. Pain 2010, 148:26-35.

• Fuller SJ, McMillan DG, Renz MB, Schmidt M, Burke IT, Stewart DI

  Extracellular electron transport mediated Fe(III) reduction by a community of alkaliphilic bacteria that use flavins as electron shuttles. Appl Environ Microbiol. 2014,  80:128-37.

• Bischoff SJ*, Schmidt M*, Lehmann T, Schwab M, Matziolis G, Saemann A, Schiffner R

  Renal glucose release during hypoglycemia is partly controlled by sympathetic nerves - a study in pigs with unilateral surgically denervated kidneys. Physiol Rep 2015, 3: e12603.

• Schiffner R, Rodríguez-González GL, Rakers F, Nistor M, Nathanielsz PW, Daneva T, Schwab M, Lehmann T, Schmidt M

  Effects of Late Gestational Fetal Exposure to Dexamethasone Administration on the Postnatal Hypothalamus-Pituitary-Adrenal Axis Response to Hypoglycemia in Pigs. Int J Mol Sci 2017, 18:2241.

• Schiffner R, Bischoff SJ, Matziolis G, Schmidt M

  Evaluation of a vital staining protocol with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride for cancellous bone in a sheep model. Res Vet Sci. 2017, 114:131-135.

• Schiffner R, Reiche J, Brodt S, Brinkmann O, Bungartz M, Matziolis G,  Schmidt M

  A Simple Procedure for the Evaluation of Bone Vitality by Staining with a Tetrazolium Salt. Int J Mol Sci. 2017, 18:1646.

• Kaiser A,  Schmidt M, Huber O, Frietsch JJ, Scholl S, Heidel FH, Hochhaus A, Müller JP, Ernst T

  SIRT7: an influence factor in healthy aging and the development of age-dependent myeloid stem-cell disorders. Leukemia. 2020, Mar 25. doi: 10.1038/s41375-020-0803-3. (Epub ahead of print)

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