Enthemmung und Hemmung der HCN2-Kanalfunktion durch Bindung von Liganden an die zyklische Nukleotid-Bindungsdomäne
Hyperpolarisations-aktivierte cyclische Nukleotid-modulierte (HCN) Kanäle sind relevante Krankheitsfaktoren, werden durch cAMP und cGMP aktiviert und bestehen aus vier Untereinheiten. Die Modulation der Kanalfunktion wird durch die C-terminale Region bedingt, die eine cyclische Nukleotid-Bindungsdomäne (CNBD) und eine C-Linker- (CL-) Region enthält. Wir gehen der zentralen Frage nach, inwiefern Änderungen der Konformationsdynamik und Energetik der tetrameren CL-CNBD bei der Bindung von cyclischen Nukleotiden (cNMP) mit dem ligandenabhängigen channel gating zusammenhängen und fokussieren uns auf HCN2 aus Säugetieren. Wir beabsichtigen, diese Frage auf atomistischer Ebene durch molekulare Simulationen und Modellierung unter Nutzung der kürzlich verfügbaren Volllängenstrukturen von hHCN1 und hHCN4 zu beantworten.
In der ersten Förderperiode charakterisierten wir I) neuartige cAMP- und cGMP-Derivate, die an N8 durch Alkyl- oder Heteroalkylketten substituiert waren, und schlugen eine komplizierte Enthalpie-Entropie-Kompensation vor, die der höheren apparenten Affinität der Derivate mit längeren Alkylketten zugrunde liegt, II) entwickelten eine Reihe neuer fluoreszierender cAMP- oder cGMP-Derivate, III) zeigten, dass N6-modifizierte cAMP-Derivate, die die Proteinkinase A aktivieren, auch als Agonisten der murinen HCN2-Kanäle wirken, IV) entwickelten einen Ensemble- und Rigiditätstheorie-basierten Störungsansatz zur Analyse der dynamischen Allosterie und V) wendeten ihn auf einen membrangebundenen Transporter, Rezeptor und HCN2-Kanal an. In Bezug auf letzteren zeigen vorhergesagte Signalwege den Einfluss veränderter struktureller Dynamik auf die allosterische Signalübertragung zwischen den vier CL-CNBD-Untereinheiten. In weiteren Vorarbeiten VI) charakterisierten wir funktionell und strukturell Wechselwirkungen zwischen gegenüberliegenden Untereinheiten in HCN2 und VII) untersuchten den Einfluss der Entkopplung von CL-CNBD vom Transmembrankern durch Glycininsertionen.
Aufbauend darauf werden wir untersuchen, I) wie sich Wechselwirkungen zwischen gegenüberliegenden Untereinheiten auf die aktivierungsabhängige CL-CNBD-Rotation auswirken als auch II) die allosterische Kopplung zwischen der Region gegenüberliegender Untereinheiten und der cNMP-Bindungsstelle. Weiterhin werden wir III) die Signalübertragung zwischen CL-CNBD und dem Transmembrankern in Varianten mit einer definierten Anzahl von entkoppelten und / oder nicht-funktionellen CL-CNBDs und IV) den Beitrag der Helices D und E für die Affinität von cAMP und für die allosterische Signalübertragung untersuchen, V) selektive HCN-Agonisten entwickeln und Inhibitoren identifizieren, die den inaktiven Zustand des CL-CNBD stabilisieren sowie VI) ein Strukturmodell von HCN2 mit offener Kanalpore erstellen. Diese Studien werden erheblich unser Verständnis verbessern, wie strukturelle Dynamik sowie Enthemmung und Hemmung der HCN2-Kanalfunktion mit der Ligandenbindung an die CL-CNBD gekoppelt sind.
