Methoden der Zellphysiologie

Abb. 1: Darstellung des membranständigen Bradykinin-Rezeptors 2 (Neurone 2 Tage in Kultur)

Ansprechpartner: PD Dr. Gisela Segond von Banchet

1. Anlegen von Primärkulturen von Neuronen aus den Hinterwurzelganglien.

Erwachsene Ratten oder Mäuse werden durch CO2 getötet, und die Hinterwurzelganglien werden entnommen. Nach einer enzymatischen Behandlung mit Kollagenase und Trypsin werden die Neurone mit einer Pasteurpipette mechanisch vereinzelt und gewaschen. Dann werden die Zellen in Nährmedium aufgenommen und auf beschichtete Glasplättchen (Ø 13 mm) aufgebracht. Der Zeitbedarf für so eine Präparation beträgt etwa 5 bis 6 Stunden. Die Zellen werden bei 37°C und einer Atmosphäre mit 5 % CO2 je nach Fragestellung für 1-4 Tage kultiviert. Die Zellen müssen täglich gefüttert werden.

2. Darstellung von Proteinen an histologischen Schnitten von Hinterwurzelganglien mit spezifischen Antikörpern (Abb. 2 und 3).

Die Hinterwurzelganglien werden präpariert und sofort in 4% Paraformaldehyd für mindestens 24 Stunden bei 4°C fixiert. Dann werden die Ganglien in Paraffin eingebettet und es werden Schnitte von 5 µm hergestellt. Die Paraffinschnitte werden durch eine Alkoholreihe entparaffiniert, gespült, und eine Behandlung im Autoklaven bei 120°C (1 bar) für 15 Minuten wird angeschlossen. Nach dem Blocken unspezifischer Bindungsstellen werden über Nacht bei 4°C die Antikörper zugesetzt. Nach dem Waschen werden die Schnitte mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der sekundäre Antikörper ist entweder fluoreszenzmarkiert oder dessen Bindung wird mit der ABC-Peroxidase-Methode sichtbar gemacht. Die Schnitte werden entwässert und in Kunstharz eingebettet und können nach dem Trocknen mit dem Mikroskop betrachtet werden.
Neben Hinterwurzelganglien werden auch histologische Schnitte von peripheren Nerven und vom Rückenmark angefertigt und untersucht.

Abb. 2: Darstellung von Rezeptoren für das Zytokin TNFa. Die dunkel markierten Neurone exprimieren einen TNF-Rezeptor. Dabei handelt es sich vor allem um kleine bis mittelgroße Neurone.

Abb. 3: Darstellung des TTX-resistenten spannungsgesteuerten Na+-Kanals Nav 1.8. Die hellen Zellen exprimieren den Na+-Kanal Nav 1.8.

3. Darstellung der intrazellulären Kalziumkonzentration in lebenden Neuronen: Kalzium-Imaging

Mit der Methode des Kalzium-Imagings kann untersucht werden, ob lebende, kultivierte Neurone aus Hinterwurzelganglien durch Mediatoren so aktiviert werden, dass sich ihre intrazelluläre Kalziumkonzentration ändert. Das Kalzium kann dabei entweder durch Kanäle in der Plasmamembran fließen oder aus intrazellulären Kalziumspeichern stammen. Die Neurone werden zunächst für 30 Minuten mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff (Fura-2/AM). Danach werden die Neurone in eine Versuchskammer an einem Mikroskop eingebracht. Das Mikroskop ist über eine hochauflösende Digitalkamera mit einem Auswertesystem verbunden. Die Zellen werden mit Licht der Wellenlänge 340 nm und 380 nm angeregt, und gemessen wird das abgestrahlte Licht der Wellenlänge 510 nm. So kann die Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration in den Neuronen im zeitlichen Verlauf berechnet werden.

4. Weitere Methoden

Kultivierung von Neuroblastomazellen
Kultivierung von Zellen aus der Synovia des Kniegelenks
Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark
Ko-Kultivierug von Makrophagen und Neuronen aus den Hinterwurzelganglien
Cobalt-uptake
ELISA
PCR und real-time PCR