Methoden

Patch-Clamp-Technik

Die Patch-Clamp-Technik ist ein Messverfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung von Zellmembranen bzw. der sich darin befindenden Ionenkanäle oder -transporter. In unserem Labor verwenden wir unterschiedliche Konfigurationen dieser Technik.

Grundlage der Ionenkanaluntersuchung ist die Messung des durch sie fließenden Ionenstromes. Es kann sowohl der Strom durch eine Vielzahl von Kanälen als auch durch ein einzelnes Kanalprotein gemessen werden. Je nach Kanaltyp wird die Abhängigkeit der Kanalaktivität von der anliegenden Spannung oder nach Applikation von Ligandenmolekülen gemessen.

Konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie (Konfokale PCF)

Um nicht nur die Aktivierung, sondern zusätzlich die Ligandenbindung von Ionenkanälen zu studieren, etablierten wir in unserem Labor die Patch-Clamp-Fluorometrie (Zheng und Zagotta, 2000; Zheng und Zagotta, 2003) unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops (konfokale PCF) (Biskup et al., 2007). Mit dieser Technik ist es uns möglich, Ligandenbindung und Aktivierung simultan zu beobachten und miteinander in Beziehung zu setzen.

Geblitzte Photolyse

Die Untersuchung des Zeitverlaufes der Aktivierung ligandenabhängiger Ionenkanäle erfordert eine sehr schnelle Ligandenapplikation an die Kanalproteine. Um dies zu realisieren, nutzen wir die Technik der geblitzten Photolyse. Dabei werden sogenannte „gecagte“ Ligandenmoleküle verwendet, also Moleküle, die durch chemische Modifikation so verändert werden, dass sie nicht mehr in der Lage sind, den Kanal zu aktivieren. Erst die Abspaltung der modifizierenden Gruppe durch Licht einer bestimmten Wellenlänge versetzt die Ligandenmoleküle wieder in die Lage an den Kanal zu binden. Durch diese Methode gelingt es, die Ligandenkonzentration innerhalb weniger hundert Mikrosekunden von Null auf einen bestimmten Wert anzuheben.

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)

FRET findet statt, wenn ein Donor Fluorophor in die Nähe (< 10 nm) eines entsprechenden Akzeptor Moleküls kommt. Der Donor kann Anregungsenergie an den Akzeptor übertragen, welcher wiederum Energie in Form von Fluoreszenz abgeben kann. Wenn FRET stattfindet nehmen sowohl die Fluo-reszenz-Intensität, als auch die Fluoreszenz-Lebensdauer des Donors ab, während die Intensität des Akzeptors zunimmt. Indem man die FRET Effizienz bestimmt, kann man Informationen über den Abstand und die relative Orientierung der FRET Partner zueinander erhalten. Dabei können nicht nur intermolekulare Interaktionen untersucht werden, sondern auch intramolekulare Konformations-änderungen.

Molekularbiologische Methoden

Zu den in unserem S1-Labor etablierten molekular- und zellbiologischen Methoden gehören DNA- und RNA-Isolierung, Klonierungen, ortsgerichtete Mutagenesen, Konstruktion unterschiedlicher Fusionsproteine, Sequenzanalysen, RT-PCR, Herstellung von cRNA für die Oozyteninjektion sowie stabile und transiente Transfektionen unterschiedlicher Zelllinien zur heterologen Expression und Charakterisierung von Ionenkanälen und Rezeptoren mit im Labor etablierten biophysikalischen Methoden.