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Institut für Physiologie II - Herz-Kreislauf-Physiologie
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Startseite Physiologie / Verbundförderungen / DynIon

Forschergruppe DynIon

Funktionale Dynamik von Ionenkanälen und Transportern

Die DFG-Forschergruppe DynIon kombiniert experimentelle und mathematische Strategien, um Ionenkanäle und Ionentransporter zu untersuchen. Der Fokus liegt dabei auf der Ligandenaktivierung dieser Proteine, einschließlich obligatorisch ligandenabhängiger Ionenkanäle (ionotrope Glutamatrezeptoren), Ionenkanäle, die durch Liganden lediglich moduliert werden (K2P-Kanäle, spannungsgesteuerter Kaliumkanäle, durch zyklische Nukleotide modulierte Ionenkanäle) und Transportern, die kanal-ähnliche Konformationen annehmen können (EAAT-Glutamattransporter und CLC-Anionenkanäle/Anionen-Protonenaustauscher).

Eine Vielzahl experimenteller Ansätze von Elektrophysioloige, über Biochemie und Fluorometrie bis hin zu Strukturbiologie wird mit mathematischen Methoden einschließlich Molekulardynamik-Simulation (MD-Simulation), hybrider quantenmechanischer/molekülmechanischer Simulationen, Energie-Berechnungen sowie Modellerierung von Markov-Zustandsmodellen kombiniert.

Unsere Strategie ist es, Synergien zwischen Computersimulationen und Experiment zu fördern und zu nutzen, um neue Einsichten in das Verhalten ausgewählter Kanal- bzw- Transporterproteine zu erhalten.

Innerhalb dieses Verbundes bearbeiten Klaus Benndorf und Jana Kusch das Projekt P2 und Indra Schröder das Projekt P10.

P2 Untersuchungen zur Funktion der Bindungsdomäne für zyklische Nukleotide für die Aktivierung von HCN-Kanälen

Schematische Darstellung CN-modulierter Ionenkanäle. (A) Schematische Darstellung eines CN-modulierten Ionenkanals mit vier Untereinheiten. Die Untereinheiten bilden eine zentrale kationenselektive Pore. Jeder homomere bzw. heteromere Kanal trägt vier intrazelluläre Bindungsstellen für zyklische Nukleotide (CNBD). (B) Schematische Darstellung einer HCN-Kanal-Untereinheit mit sechs Transmembrandomänen S1-S6. Die ionenleitende Pore mit dem Selektivitätsfilter wird im Wesentlichen von den Domänen S5 und S6 und dem verbindenden Linker gebildet. Die CNBD ist über den C-Linker mit dem C-terminalen Ende von S6 verbunden.
Schematische Darstellung CN-modulierter Ionenkanäle. (A) Schematische Darstellung eines CN-modulierten Ionenkanals mit vier Untereinheiten. Die Untereinheiten bilden eine zentrale kationenselektive Pore. Jeder homomere bzw. heteromere Kanal trägt vier intrazelluläre Bindungsstellen für zyklische Nukleotide (CNBD). (B) Schematische Darstellung einer HCN-Kanal-Untereinheit mit sechs Transmembrandomänen S1-S6. Die ionenleitende Pore mit dem Selektivitätsfilter wird im Wesentlichen von den Domänen S5 und S6 und dem verbindenden Linker gebildet. Die CNBD ist über den C-Linker mit dem C-terminalen Ende von S6 verbunden.

Im Rahmen dieses Projektes untersuchen wir die Funktion des C-linkers und der Bindungsstelle für zyklische Nukleotide (CN) in HCN- (hyperpolarization-activated and cyclic-nucleotide modulated) Kanälen von Säugern. Diese Kanäle bestehen aus vier Untereinheiten mit je einer CN-Bindungsstelle (CNBD) am C-terminus, die mit der letzten Transmembran-Domäne S6 über einen sogenannten C-linker (CL) verbunden ist.

Wir setzen die konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie (cPCF) ein, eine Methode, die elektrophysiologische Techniken und konfokale Fluoreszenzmikroskopie miteinander kombiniert, um

  • die aktivierungs-abhängige Bindung des fluoreszierenden cAMP-Derivatives fcAMP zu untersuchen
  • aktivierungs-abhängige Konformationsänderungen der CL-CNBD-Region mit Hilfe der intrinsisch fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren Anap sowie mit Hilfe von durch Click-Chemie gekoppelten Farbstoffen zu studieren.

Die Daten werden in enger Zusammenarbeit mit Holger Gohlke (Universität Düsseldorf) und Frank Noé (Freie Universität Berlin) mit Hilfe von Markov-Modellen und MD-Simulationen kinetisch interpretiert.

 

Dr. Jana Kusch

Telefon: 03641 - 9 397668

Prof. Dr. Klaus Benndorf

Telefon: 03641 - 9 397651

P10 Neue Ansätze zur Untersuchung der Signalkette des spannungsabhängigen Gatings im Selektivitätsfilter von K+-Kanälen

Schematische Darstellung der Regulation von Schaltprozessen im Selektivitätsfilter.
Schematische Darstellung der Regulation von Schaltprozessen im Selektivitätsfilter.

Gegenstand dieses Projektes ist ein spannungsabhängiger Schaltprozess im Selektivitätsfilter (SF) eines viralen K+-Kanals (Kcv) mit Sub-Millisekunden-Kinetik. Durch eine Kombination von zellfreien Einzelkanalmessungen und computergestützten Methoden werden wir herausfinden, a) wie die Besetzung mit Ionen die Flexibilität des SF moduliert, b) wie das Signal von der Sensorbindungsstelle zum Gate übertragen wird und c) die Position und den Mechanismus des Gates identifizieren.

Hochauflösende Experimente in planaren Lipiddoppelschichten werden Einzelkanäle charakterisieren. Dabei werden modifizierte Ionen-Filter-Wechselwirkungen durch verschiedene permeierende Ionen und Punktmutationen induziert. Punktmutationen kommen auch beim Studium der Rolle des Wasserstoffbrückennetzwerks zwischen der Porenhelix und dem SF zum Einsatz. ANM-Berechnungen (Anisotrope Netzwerk Modelle) dienen als erster sondierender Ansatz zur Wirkung der Mutationen und der ermittelten Ionenbesetzungen. Dies wird Abschätzungen über die damit verbundenen Veränderungen der Flexibilität und die Hauptkomponenten (principal components) der strukturellen Dynamik liefern. Die vertiefte Identifikation der molekularen Mechanismen geschieht dann durch globale Fits der funktionellen Daten mit kinetischen Markov Modellen und theoretisch durch MD-Simulationen.

 

Prof. Dr. Indra Schröder

Telefon: 03641 - 9 397686