SFB Transregio ReceptorLight

Hochleistungs-Lichtmikroskopie zur Aufklärung der Funktion von Membranrezeptoren

Als Reaktion auf die Bindung sogenannter Liganden generieren Membranrezeptoren Signale, die die Zellen eines Organismus auf vielfältige Weise beeinflussen können. Im Rahmen des SFB Transregio 166 ReceptorLight wurden vielfältige lichtmikroskopische Techniken, teilweise mit höchster räumlicher und/oder zeitlicher Auflösung angewendet und weiterentwickelt, um neue Erkenntnisse zur Funktion von Membranrezeptoren zu gewinnen. Neue lichtmikroskopische Methoden ermöglichten, essentielle Einblicke in die Funktion von Membranrezeptoren, zum Beispiel in Bezug auf die Geschwindigkeitskonstanten der Bindung von Liganden sowie der sich anschließenden Konformationsänderungen innerhalb der Rezeptorproteine zu gewinnen. In Bezug auf die Lokalisation der Rezeptoren wurde eine räumliche Auflösung im Bereich von 20 nm erreicht, was weit unterhalb der von Ernst Abbe beschriebenen optischen Auflösungsgrenze des Lichtes liegt.

Die Arbeitsgruppen in Jena und Würzburg bündelten ihre methodologische Expertisen auf dem Gebiet der High-End-Lichtmikroskopie mit denen in der Physiologie und Biophysik von Membranrezeptoren. Diese Zusammenarbeit zielte darauf ab, Funktion und Verteilung verschiedener Rezeptortypen zu studieren und parallel die Entwicklung neuer lichtmikroskopischer Techniken voranzutreiben. Die 21 Gruppen des Konsortiums wendeten unter anderem folgende Methoden an: Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, 3-Dimensionales Zwei-Photonen-Calcium-Imaging, Einzelmolekülstrategien, Tip-enhanced Raman-Spectroscopy, konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie, Förster-Resonanz-Energie-Transfer-Analysen, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskope sowie Kombinationen aus diesen. Diese Methoden und komplexen mathematischen Algorithmen für die Datenanalyse wurden von den Mitgliedern des Konsortiums in enger Kooperation angewendet.

Am Institut für Physiologie II waren die folgenden Projekte angesiedelt:

A5 Zusammenhang zwischen Bindungen einzelner Liganden und Aktivierung einzelner HCN- und CNG-Kanäle

Von CNGA2-Kanälen sollen die Bindung einzelner markierter cGMP-Moleküle und die Einzelkanal-Aktivität simultan gemessen werden. Zusätzlich soll eine Analyse für aufgeklebte Membranen entwickelt werden, um die Verweildauer einzelner markierter cAMP-Moleküle an den vier Untereinheiten eines HCN2-Kanals zu analysieren. Neue cGMP- und cAMP-Derivate sollen synthetisiert werden. Die Resultate sollen zu einem besseren Verständnis der Interaktion der vier Untereinheiten in den Kanälen führen und den Effekt der Spannung auf diese Interaktion in HCN2-Kanälen erklären.

Prof. Dr. Klaus Benndorf

Telefon: 03641 - 9 397651

B1 Untersuchung der Assemblierung, der Ligandenbindung und des Schaltens heterotetramerer CNG-Kanäle über FRET-Messungen

Ligandenabhängige Ionenkanäle sind multimere Membranproteine, die eine Schlüsselrolle bei der Signalübertragung in verschiedenen Zelltypen spielen. Um die Funktionsweise dieser Kanäle zu verstehen, ist eine detaillierte Kenntnis des Aktivierungsmechanismus von größter Bedeutung. Im Rahmen dieses Projekts haben wir einen einfachen Ansatz entwickelt, der auf der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie (cPCF) in Kombination mit der Förster-Resonanz-Energie-Transfer-Methode (FRET) basiert, um gleichzeitig die Ligandenbindung und das Kanal-Gating in heterotetrameren CNG-Kanälen von Stäbchen zu messen. Diese Methode überwindet die technischen Einschränkungen der cPCF-Technik und ermöglicht die direkte Untersuchung der Ligandenbindung an einzelne Untereinheiten in multimeren Kanalproteinen.

Dr. Vasilica Nache

Telefon: 03641 - 9 397668

zusammen mit Christoph Biskup, Arbeitsgruppe Biomolekulare Photonik des UKJ

B7 Beziehung zwischen Ligandenbindung und Aktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren

Ziel dieses Projektes ist es, die Beziehung zwischen Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden neue ACh-Analoga synthetisiert und charakterisiert und in der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie angewendet. Nikotinische Azetylcholin-Rezeptoren gehören zur Superfamilie der neurotransmitter-gesteuerten Cys-Loop-Rezeptoren. Sie werden in verschiedenen neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen exprimiert. In zentralen und peripheren Neuronen sowie an Skelettmuskelzellen vermitteln sie eine schnelle synaptische cholinerge Transmission.

Die Stromantworten dieser liganden-gesteuerten Ionenkanäle sind durch eine schnelle Aktivierung und eine darauf folgende komplexe Desensitisierung charakterisiert. Während die Aktivierung sehr gut verstanden ist, bleiben für die Desensitisierung noch viele Fragen offen. Die in diesem Projekt erhobenen Daten sollen zu einem tieferen Verständnis der Desensitierungsprozesse in nikotinischen Azetylcholinrezeptoren des adulten Muskels beitragen und im Besonderen auch die Rolle des Clustering-Proteins Rapsyn beleuchten.

Da es sich bei den desensitisierten Zuständen um hoch-affine, elektrisch stumme Zustände handelt, liegt der technische Focus auf der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie (cPCF), eine Technik, die elektrophysiologische Patch-Clamp-Techniken mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie kombiniert. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Agonisten kann somit der Aktivierungszustand parallel mit der Ligandenbindung gemessen und beide Parameter direkt miteinander in Beziehung gesetzt werden. Wir erwarten uns somit ein kompletteres Bild über die Vorgänge während des Desensitisierungsprozesses.

Dr. Jana Kusch

Telefon: 03641 - 9 397668

C4 Kinetik metabotroper Glutamat-Rezeptoren

Die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) scheint um mehr als fünf Größenordnungen zu variieren, wobei methodische Gründe die Analysen begrenzen. Es sollen Verfahren entwickelt werden, die Aktivierungskinetik metabotroper GPCRs genau zu messen. Dazu werde Konzentrationssprünge von Agonisten, mechanisch oder durch geblitzte Photolyse induziert, sowie photosensible gebundene Agonisten verwendet. Die Rezeptor-Antwort wird über Förster-Resonanz-Energie-Transfer an Rezeptor-Konstrukten mit geeigneten Fluorophoren erfasst. Die Daten werden mit Markov-Modellen analysiert.

Prof. Dr. Klaus Benndorf

Telefon: 03641 - 9 397651