Mikroskopie der Signaltransduktion

Kommunikation zwischen Zellen erfolgt mit Hilfe von Signalmolekülen wie Hormonen oder Neurotransmittern. Diese werden von Zellen mit Hilfe spezifischer Rezeptoren erkannt. Rezeptoren stellen den wichtigsten Angriffspunkt für Arzneimittel dar. Wir untersuchen ihre Funktion und Regulation an zahlreichen Rezeptoren, um ihre allgemeinen Funktionsprinzipien zu erfassen. Der Schwerpunkt unserer Arbeiten liegt in der Erforschung der Mechanismen zur Aktivierung und Deaktivierung von G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Insbesondere im Vordergrund des Interesses stehen dabei die Entwicklung neuer Verfahren zur Untersuchung dieser Mechanismen in Echtzeit und lebenden Zellen. Dazu werden FRET-basierte Sensoren für GPCRs entwickelt, die es erlauben Konformationsänderungen dieser Rezeptoren mit einer zeitlichen Auflösung im Millisekundenbereich zu messen. Mit Hilfe solcher Methoden können Liganden direkt am Rezeptor untersucht werden. Dadurch können die Effekte potentieller Arzneimittel an diesen Proteinen im Detail studiert werden und mit Effekten auf nachgeschaltete Signalwege korreliert werden

Da die Rezeptordeaktivierung die Dauer eines Signals regulieren kann, ist die Deaktivierung eines GPCRs ebenfalls von großem Interesse. Hier liegt der Schwerpunkt unserer Arbeiten insbesondere auf der Interaktion von Rezeptoren mit Proteinen der β-Arrestin Familie und der Regulation dieser Interaktion. Hier wird die Frage untersucht, inwiefern bestimmte Proteindomänen oder potentielle Phosphorylierungstellen des Rezeptors die Interaktion mit β-Arrestinen beeinflussen bzw. vermitteln. Da β-Arrestine allerdings nicht nur die Abschaltung eines Rezeptors vermitteln, sondern ebenfalls selbst Ausgangspunkt einer neuen Signalkaskade sein können, interessiert uns ebenfalls die Fragestellung ob es potentielle Arzneimittel gibt, die eine so genannte funktionelle Selektivität aufweisen und gezielt nur diesen neuen Signalweg anschalten ohne den klassischen Signalweg über G-Proteine zu stimulieren.

Ein weiteres Interessensgebiet ist die Weiterentwicklung von Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen, insbesondere die Tetracystein-biarsenical-Tag-Methode steht hier im Vordergrund. Hier sollen neue Varianten der genetisch kodierten Aminosäure Sequenzen auf ihr Bindungsverhalten von FlAsH oder ReAsH getestet werden, sowie mögliche neue Farbvarianten entwickelt werden.

Forschungsschwerpunkte

G-protein-coupled receptors (GPCR)
Receptor β-arrestin interactions
Site specific fluorescent labelling of proteins in living cells using tetracystein-biarsenical-tag-technology
Fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and the design of FRET-based probes to image signalling pathways

Forschungsprojekte:

DFG TRR166 Projekt C02 - Carsten Hoffmann

Wie beeinflusst die Rezeptordynamik die Wirksamkeit und Verweilzeit von Liganden an Adenosinrezeptoren?

Rezeptor-Ligandenbindung wird derzeit nur statisch beschrieben und berücksichtigt nicht die Konformationsdynamik der Rezeptoren, sowie deren Einfluss auf die Verweilzeit von Liganden. Mit Hilfe hochaufgelöster Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Messungen sollen dynamische Konformationsänderungen und Rezeptor-Ligandenbindung parallel beobachtet werden. Dieser Ansatz erlaubt die Messung von mikro- und makroskopischen Assoziation- oder Dissoziationskonstanten und die Verweilzeit von Liganden mit deren Wirksamkeit parallel in lebenden Zellen zu erfassen. Als Modelrezeptoren werden in diesem Projekt Adenosinrezeptoren untersucht.

Beteiligte Mitarbeiter: Nelly Rüttiger (Doktorandin), Carsten Hoffmann (Projektleiter)

Förderung: DFG TRR166 Projekt C02, Förderungszeitraum 2015-2019

Literatur:

Hoffmann, M. Castro, A. Rinken, R. Leurs, S.J. Hill, H.F. Vischer (2015)
Ligand residence time at GPCRs why we should take our time to study it.
MolPharm, 88: 552-60; doi: 10.1124/mol.115.099671
A.D. Stumpf, C. Hoffmann (2016)
Optical probes based on G-protein-coupled receptors -added work or added value?
Br J Pharmacol., 173: 255-266; doi: 10.1111/bph.13382.
Kauk, C. Hoffmann (2018)
Intra- and Intermolecular FRET Sensors for GPCRs monitoring conformational changes and beyond
Trends Pharmacol. Sci., 39 (2): 123-135. doi: 10.1016/j.tips.2017.10.011
Grundmann, N. Merten, D. Malfacini, A. Inoue, P. Preis, K. Simon, N. Rüttiger, N. Ziegler, T. Benkel, N.K. Schmitt, S. Ishida, I. Müller, R. Reher, K. Kawakami, A. Inoue, U. Rick, T. Kühl, D. Imhof, J. Aoki, G.M. König, C. Hoffmann, J. Gomeza, J. Wess, E. Kostenis (2018)
Lack of beta-arrestin signaling at “zero functional G”.
Nature Communication, 9:341; doi: 10.1038/s41467-017-02661-3

EU- Projekt - Carsten Hoffmann

Kürzlich ist es uns gelungen zu belegen, dass Frizzled-Rezeptoren einen vergleichbaren molekularen Aktivierungsmechanismus aufweisen, wie ihn andere G-Protein gekoppelte Rezeptoren auch durchlaufen. Darüber hinaus konnten wir gemeinsam mit der Pharmazeutischen Chemie der Universität Würzburg (Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe und Prof. Dr. Michael Decker) den ersten Liganden mit Selektivität für den muskarinischen Azetylcholine Rezeptor beschreiben, der sich mit Hilfe von Licht geeigneter Wellenlänge zwischen Agonist und Antagonist umschalten läßt. Solche Liganden ermöglichen neue therapeutischer Ansätze und öffnen ein neues Forschungsfeld der Photopharmakologie.

Förderung:

EU-Förderung Grant agreement number 608180: Marie-Curie International Training Network: „WntsApp WNT-mediated signal relay in stem cells and oncogenesis from basic biology to applications“ ; Funding period: 2013-2017

Förderung durch das „Bayrisches Staatsministerium für Bildung und Kultus, Wissenschaft und Kunst“: Elitenetzwerk Bayern Internationale Doktorandenkolleg „Receptor Dynamics: Emerging Paradigms for Novel Drugs“; Teilprojekt 6, Funding period: 2014-2018

Literatur:

Messerer, M. Kauk, D. Volpato, M.C. Alonso Canizal, J. Klöckner, U. Zabel, S. Nuber, C. Hoffmann*, U. Holzgrabe (2017)
FRET Studies of Quinolone-Based Bitopic Ligands and their structural analogues at the Muscarinic M1 Receptor.
ACS Chem Biol. 12, 833-843; doi: 10.1021/acschembio.6b00828.
*Co-Corresponding author
Agnetta, M. Kauk, M.C. Alonso Canizal, R. Messerer, U. Holzgrabe, C. Hoffmann*, M. Decker (2017)
A photoswitchable dualsteric ligand controlling receptor afficacy.
Angewandte Chemie International Edition 56 (25): 7282-7287; doi: 10.1002/anie-201701524
*Co-Corresponding author
Schreiber, M. Kauk, H. Heil, M. Emmerling, I. Tesmer, M. Kamp, S. Höfling, U. Holzgrabe, C. Hoffmann, K. Heinze (2018)
Enhanced fluorescence resonance energy transfer in G-protein-coupled receptor probes by nano-coated microscopy coverslips.
ACS Photonics, 5(6): 2225-2233; doi: 10.1021/acsphotonics.8b00072
Littmann, T. Ozawa, C. Hoffmann, A. Buschauer and G. Bernhardt (2018)
A split luciferase-based probe for quantitative proximal determination of Gαq signalling in live cells
Scientific Reports, 8:17179; doi: 10.1038/s41598-018-35615-w
S.C. Wright, M.C. Alonso Cañizal, T. Benkel, K. Simon, C. Le Gouill, P. Matricon, Y. Namkung, V. Lukasheva, G.M. König, S.A. Laporte, J. Carlsson, E. Kostenis, M. Bouvier, G. Schulte, C. Hoffmann (2018)
FZD5 is a Gq-coupled receptor exhibiting the functional hallmarks of prototypical GPCRs.
Science Signaling, 11, issue 559, eaar5536; doi: 10.1126/scisignal.aar5536

Leica SP8 mit Lightning-Modul

Das Leica SP8 Laser Scanning Mikroskop mit Lightning-Modul und 4 Detektoren stellt zusammen mit der Laserausrüstung, die Basis für Forschungsprojekte hinsichtlich hochauflösender Mikroskopie dar. Inhaltlich steht die Nutzung des Systems für Untersuchungen in lebenden Zellen im Fokus. Hierbei steht insbesondere die Untersuchung der Rezeptordynamik und der Aktivierungsmechanismen von G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) im Vordergrund. GPCRs stellen eine sehr große Klasse von membranständigen Rezeptoren dar, die eine Vielzahl von Signalen vom äußeren einer Zelle in das Zellinnere übertragen. Diese Rezeptoren nehmen in der Kommunikation von Zellen eine zentrale Schlüsselstellung ein und sind essentiell in der Signaltransduktion. Geschätzte 30 Prozent der Arzneistoffe haben ihren Angriffspunkt an solchen Rezeptoren. Bei der Übertragung der Information, die durch die Bindung von Hormonen weitergeleitet werden muss, kommt es zu einer Konformationsänderung im Rezeptorprotein und in der Folge zur Aktivierung verschiedener Signalwege innerhalb der Zelle. Da oftmals verschieden Signalwege durch den gleichen Rezeptor angeschaltet werden können, geht es in unseren Arbeiten um mehrere Fragestellungen:

Lassen sich Konformationsänderungen solcher Rezeptoren gezielt durch Liganden beeinflussen?
Ist es möglich selektive Konformationsänderungen mit einzelnen Signalwegen zu korrelieren?
Wie sind verschiedenen Signalwege zeitlich und räumlich organisiert?

Diese Forschungsthemen erfordern eine Erhöhung des optischen Auflösungsvermögens eines Standard-Laser-Scanning-Mikroskops (LSM), da die intrazellulären Strukturen oftmals jenseits von 220 nm liegen. Die Auflösungsgrenze eines Standard-LSM liegt bei einer Wellenlänge von 488nm und Nutzung eines 63x/1.4 –Objektives.

Die AOBS Technik ermöglicht es zudem, einzelne Wellenlängen für die Anregung selektiv zu filtern und damit zusätzlich die Überlagerung der Signale zu minimieren. Die Scangeschwindigkeit von 7 Bildern pro Sekunde (bei 512*512 pixel) bzw. 84 Bilder pro Sekunde (bei 512*16 Pixel) ermöglicht es, zeitliche Auflösungen in lebenden Zellen umzusetzen, die vollkommen neue Einblicke in dynamische Vorgänge während der Kommunikation innerhalb von Zellen darstellen werden. Das Lightning Modul hilft die konfokalen Bilder deutlich zu verbessern in dem in Kombination mit den beiden HyD Detektoren die Auflösung auf bis zu 140nm erhöhen und gleichzeitig dynamische Vorgänge mit zeitlicher Auflösung von

Förderung: HSB 2018 0019