Microscopy of signal-transduction

Communication between cells occurs through signaling molecules like hormones or neurotransmitters that are recognized by specific receptors, which constitute the primary class of drug targets. We investigate their function and regulation in various model systems to explore general mechanisms and functional principles. In order to transduce a signal of a hormone or prescription drug across the plasma membrane G-protein-coupled receptors (GPCRs) need to undergo conformational changes. The focus of our research is to investigate such conformational changes during GPCR activation and deactivation. Therefore we develop FRET-based probes for GPCRs to image the conformational change in living cells and millisecond time resolution. The use of such FRET-based sensors allows us to study receptor ligand interaction directly at the level of the receptor itself. Thus we are able monitor the effects of potential future drugs at the protein level and can correlate the observed data with effects on different signalling pathways triggered by receptor activation.

Receptor interaction with b-arrestin is an important regulatory key element in the termination of G-protein-dependent receptor signalling. The interaction of a GPCR and β-arrestin is regulated by ligand binding and receptor phosphorylation by specific receptor kinases. Since β-arrestins not only turn off G-protein-dependent-signalling but represent starting points for novel signalling cascades, we are also interested to investigate receptor ligands which are able to discriminate between G-protein and β-arrestin mediated receptor signalling. Such compounds are called biased ligands and are of great value for basic research and hold the promise for fewer side effects for patient treatment.

Last but not least we are interested in the development of novel approaches to fluorescently label proteins. Of special interest are further developments of the tetracystein-biarsenical-tag technology with emphasis on the improvements of amino acid sequence motifs for labelling with FlAsH or ReAsH, as well as the development of novel colour variants of these small organic dyes.

Research focus

G-protein-coupled receptors (GPCR)
Receptor β-arrestin interactions
Site specific fluorescent labelling of proteins in living cells using tetracystein-biarsenical-tag-technology
Fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and the design of FRET-based probes to image signalling pathways

DFG TRR166 Projekt C02 - Carsten Hoffmann

Wie beeinflusst die Rezeptordynamik die Wirksamkeit und Verweilzeit von Liganden an Adenosinrezeptoren?

Rezeptor-Ligandenbindung wird derzeit nur statisch beschrieben und berücksichtigt nicht die Konformationsdynamik der Rezeptoren, sowie deren Einfluss auf die Verweilzeit von Liganden. Mit Hilfe hochaufgelöster Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Messungen sollen dynamische Konformationsänderungen und Rezeptor-Ligandenbindung parallel beobachtet werden. Dieser Ansatz erlaubt die Messung von mikro- und makroskopischen Assoziation- oder Dissoziationskonstanten und die Verweilzeit von Liganden mit deren Wirksamkeit parallel in lebenden Zellen zu erfassen. Als Modelrezeptoren werden in diesem Projekt Adenosinrezeptoren untersucht.

Beteiligte Mitarbeiter: Nelly Rüttiger (Doktorandin), Carsten Hoffmann (Projektleiter)

Förderung: DFG TRR166 Projekt C02, Förderungszeitraum 2015-2019

Literatur:

Hoffmann, M. Castro, A. Rinken, R. Leurs, S.J. Hill, H.F. Vischer (2015)
Ligand residence time at GPCRs why we should take our time to study it.
MolPharm, 88: 552-60; doi: 10.1124/mol.115.099671
A.D. Stumpf, C. Hoffmann (2016)
Optical probes based on G-protein-coupled receptors -added work or added value?
Br J Pharmacol., 173: 255-266; doi: 10.1111/bph.13382.
Kauk, C. Hoffmann (2018)
Intra- and Intermolecular FRET Sensors for GPCRs monitoring conformational changes and beyond
Trends Pharmacol. Sci., 39 (2): 123-135. doi: 10.1016/j.tips.2017.10.011
Grundmann, N. Merten, D. Malfacini, A. Inoue, P. Preis, K. Simon, N. Rüttiger, N. Ziegler, T. Benkel, N.K. Schmitt, S. Ishida, I. Müller, R. Reher, K. Kawakami, A. Inoue, U. Rick, T. Kühl, D. Imhof, J. Aoki, G.M. König, C. Hoffmann, J. Gomeza, J. Wess, E. Kostenis (2018)
Lack of beta-arrestin signaling at “zero functional G”.
Nature Communication, 9:341; doi: 10.1038/s41467-017-02661-3

EU- Projekt - Carsten Hoffmann

Kommunikation zwischen Zellen erfolgt mit Hilfe von Signalmolekülen wie Hormonen oder Neurotransmittern. Diese werden von Zellen mit Hilfe spezifischer Rezeptoren erkannt. Rezeptoren stellen den wichtigsten Angriffspunkt für Arzneimittel dar. Wir untersuchen ihre Funktion und Regulation an zahlreichen Rezeptoren, um ihre allgemeinen Funktionsprinzipien zu erfassen. In den letzten Jahren haben wir neue Verfahren entwickelt, die es ermöglichen, die Aktivierung und Inaktivierung von Rezeptoren sowie die daraus resultierenden Signale mit Hilfe von Fluoreszenz mikroskopisch sichtbar zu machen. Damit können wir den Rezeptoren und den durch sie angestoßenen Signalen quasi bei der Arbeit zusehen.

Kürzlich ist es uns gelungen zu belegen, dass Frizzled-Rezeptoren einen vergleichbaren molekularen Aktivierungsmechanismus aufweisen, wie ihn andere G-Protein gekoppelte Rezeptoren auch durchlaufen. Darüber hinaus konnten wir gemeinsam mit der Pharmazeutischen Chemie der Universität Würzburg (Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe und Prof. Dr. Michael Decker) den ersten Liganden mit Selektivität für den muskarinischen Azetylcholine Rezeptor beschreiben, der sich mit Hilfe von Licht geeigneter Wellenlänge zwischen Agonist und Antagonist umschalten läßt. Solche Liganden ermöglichen neue therapeutischer Ansätze und öffnen ein neues Forschungsfeld der Photopharmakologie.

Förderung:

EU-Förderung Grant agreement number 608180: Marie-Curie International Training Network: „WntsApp WNT-mediated signal relay in stem cells and oncogenesis from basic biology to applications“ ; Funding period: 2013-2017

Förderung durch das „Bayrisches Staatsministerium für Bildung und Kultus, Wissenschaft und Kunst“: Elitenetzwerk Bayern Internationale Doktorandenkolleg „Receptor Dynamics: Emerging Paradigms for Novel Drugs“; Teilprojekt 6, Funding period: 2014-2018

Literatur:

Messerer, M. Kauk, D. Volpato, M.C. Alonso Canizal, J. Klöckner, U. Zabel, S. Nuber, C. Hoffmann*, U. Holzgrabe (2017)
FRET Studies of Quinolone-Based Bitopic Ligands and their structural analogues at the Muscarinic M1 Receptor.
ACS Chem Biol. 12, 833-843; doi: 10.1021/acschembio.6b00828.
*Co-Corresponding author
Agnetta, M. Kauk, M.C. Alonso Canizal, R. Messerer, U. Holzgrabe, C. Hoffmann*, M. Decker (2017)
A photoswitchable dualsteric ligand controlling receptor afficacy.
Angewandte Chemie International Edition 56 (25): 7282-7287; doi: 10.1002/anie-201701524
*Co-Corresponding author
Schreiber, M. Kauk, H. Heil, M. Emmerling, I. Tesmer, M. Kamp, S. Höfling, U. Holzgrabe, C. Hoffmann, K. Heinze (2018)
Enhanced fluorescence resonance energy transfer in G-protein-coupled receptor probes by nano-coated microscopy coverslips.
ACS Photonics, 5(6): 2225-2233; doi: 10.1021/acsphotonics.8b00072
Littmann, T. Ozawa, C. Hoffmann, A. Buschauer and G. Bernhardt (2018)
A split luciferase-based probe for quantitative proximal determination of Gαq signalling in live cells
Scientific Reports, 8:17179; doi: 10.1038/s41598-018-35615-w
S.C. Wright, M.C. Alonso Cañizal, T. Benkel, K. Simon, C. Le Gouill, P. Matricon, Y. Namkung, V. Lukasheva, G.M. König, S.A. Laporte, J. Carlsson, E. Kostenis, M. Bouvier, G. Schulte, C. Hoffmann (2018)
FZD5 is a Gq-coupled receptor exhibiting the functional hallmarks of prototypical GPCRs.
Science Signaling, 11, issue 559, eaar5536; doi: 10.1126/scisignal.aar5536

Leica SP8 mit Lightning-Modul

Das Leica SP8 Laser Scanning Mikroskop mit Lightning-Modul und 4 Detektoren stellt zusammen mit der Laserausrüstung, die Basis für Forschungsprojekte hinsichtlich hochauflösender Mikroskopie dar. Inhaltlich steht die Nutzung des Systems für Untersuchungen in lebenden Zellen im Fokus. Hierbei steht insbesondere die Untersuchung der Rezeptordynamik und der Aktivierungsmechanismen von G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) im Vordergrund. GPCRs stellen eine sehr große Klasse von membranständigen Rezeptoren dar, die eine Vielzahl von Signalen vom äußeren einer Zelle in das Zellinnere übertragen. Diese Rezeptoren nehmen in der Kommunikation von Zellen eine zentrale Schlüsselstellung ein und sind essentiell in der Signaltransduktion. Geschätzte 30 Prozent der Arzneistoffe haben ihren Angriffspunkt an solchen Rezeptoren. Bei der Übertragung der Information, die durch die Bindung von Hormonen weitergeleitet werden muss, kommt es zu einer Konformationsänderung im Rezeptorprotein und in der Folge zur Aktivierung verschiedener Signalwege innerhalb der Zelle. Da oftmals verschieden Signalwege durch den gleichen Rezeptor angeschaltet werden können, geht es in unseren Arbeiten um mehrere Fragestellungen:

Lassen sich Konformationsänderungen solcher Rezeptoren gezielt durch Liganden beeinflussen?
Ist es möglich selektive Konformationsänderungen mit einzelnen Signalwegen zu korrelieren?
Wie sind verschiedenen Signalwege zeitlich und räumlich organisiert?

Diese Forschungsthemen erfordern eine Erhöhung des optischen Auflösungsvermögens eines Standard-Laser-Scanning-Mikroskops (LSM), da die intrazellulären Strukturen oftmals jenseits von 220 nm liegen, was als Auflösungsgrenze eines Standard-LSM bei einer Wellenlänge von 488nm und Nutzung eines 63x/1.4 –Objektives gilt.

Die AOBS Technik ermöglicht es zudem einzelne Wellenlängen für die Anregung selektiv zu filtern und damit zusätzlich die Überlagerung der Signale zu minimieren. Die Scangeschwindingkeit von 7 Bildern pro Sekunde (bei 512*512 pixel) bzw. 84 Bilder pro Sekunde (bei 512*16 Pixel) ermöglicht es, zeitliche Auflösungen in lebenden Zellen umzusetzen, die vollkommen neue Einblicke in dynamische Vorgänge während der Kommunikation innerhalb von Zellen darstellen werden. Das Lightning Modul hilft die konfokalen Bilder deutlich zu verbessern in dem in Kombination mit den beiden HyD Detektoren die Auflösung auf bis zu 140nm erhöhen und gleichzeitig dynamische Vorgänge mit zeitlicher Auflösung von

Förderung: HSB 2018 0019